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檢測殘留物萊克多巴胺的含量試劑盒說明書
更新時(shí)間:2019-06-04 點(diǎn)擊量:1552

 

                     2016-01

萊克多巴胺

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物萊克多巴胺將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗萊克多巴胺抗體,加入酶標(biāo)記物后,TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物萊克多巴胺的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物萊克多巴胺的含量。

二、試劑盒特性

  • 試劑盒靈敏度:   0.05ppb
  • 孵育溫度:       25
  • 孵育時(shí)間:       30min15min
  • 樣本檢測下限

        ······································· 0.2ppb

尿        ······································· 0.1ppb

  • 交叉反應(yīng)率

萊克多巴胺(Ractopamine ···················· 100%

多巴酚丁胺(dobutamine  ····················· < 1%

沙丁胺醇(Salbutamol  ························ <0.1%

克倫特羅(Clenbuterol·························  <0.1%

  • 樣本回收率

組織、尿樣    ····························  60%~120%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12條

2

標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶

(1ml/瓶)

0ppb

0.05ppb

0.15ppb

0.45ppb

1.35ppb

4.05ppb

3

酶標(biāo)記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍(lán)色帽

5

底物A液

7ml

白色帽

6

底物B液

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

15ml

白色帽

9

2X濃縮提取液

50ml X 2

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、恒溫箱、打印機(jī)

微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道30300 µl

      劑:氫氧化鈉、濃鹽酸

五、樣本前處理步驟

  • 樣本處理前須知

a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  • 樣本前處理需配制:

配液1   0.2M 鹽酸

取 17.2ml 濃鹽酸加去離子水定容至 1L

配液2   1M 氫氧化鈉

    稱取4g 氫氧化鈉固體去離子水定溶至    

    100ml。

配液3   樣本提取液

    2X濃縮提取液用去離子水11稀釋

  • 樣本處理: 

a組織樣本的處理方法

  • 稱取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于50ml離心中,加入3ml 0.2M鹽酸(見配液1),充分振蕩3min。
  • 再加入600ul 1M 氫氧化鈉(見配液2)溶液和2.4ml 樣本提取液(見配液3)溶液,充分振蕩3min,室溫4000r/min 以上離心10min。
  • 50 µl上層液體用于分析。(注:離心后若有脂肪層,去除脂肪層或撥開脂肪層,取清澈液體進(jìn)行分析)。

樣本稀釋倍數(shù):  4

注:此方法可與克倫特羅,沙丁胺醇處理方法通用。

b尿樣樣本的處理方法

50µl清亮尿樣直接測定(如果尿樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min,直至得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

  • 測定前應(yīng)須知:
  • 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20-25)。
  • 使用之后立即將所有試劑放回28
  • ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
  • 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
  • 操作步驟:
  • 28冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20-25)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
  • 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于28。
  • 配液:洗滌液配制

將15ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水

按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子

水),或按所需用量配制洗滌液。

  • 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
  • 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
  • 將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔15-30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
  • 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25環(huán)境中避光顯色15min。
  • 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含萊克多巴胺量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.243; 0.05ppb1.816;0.15ppb1.415;0.45ppb0.74;1.35ppb0.313;4.05ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb4.05ppb;樣本2的濃度范圍是0.15ppb0.45ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中萊克多巴胺實(shí)際濃度。

2、定量分析

1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

 

百分吸光%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品濃ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中萊克多巴胺實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、 注意事項(xiàng)

  • 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
  • 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
  • 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
  • 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
  • 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
  • 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
  • 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
  • 該試劑盒反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

  • 儲藏條件:試劑盒于28保存,不要冷凍。
  •  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請放心使用。

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