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RIPA裂解液(強(qiáng))說明書
更新時間:2020-09-23 點擊量:5249

RIPA裂解液(強(qiáng))說明書

RIPA Lysis Buffer

目錄號:K2333

保存條件:4℃保存。

組分說明

 

                            Cat. No.         K2333

                             Volume        100 ml

 

 本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡介

 

  RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的組織以及細(xì)胞快速裂解液,主要用于從動物組織和哺乳

動物細(xì)胞中抽取可溶性蛋白,可用于裂解貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。按照其裂解液的強(qiáng)度

可以分為強(qiáng)、中、弱三類,具體特點和差異請參考附表2,可根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)產(chǎn)

品。RIPA裂解液(強(qiáng))可以有效提取細(xì)胞核、細(xì)胞膜和胞漿蛋白,提取的蛋白可應(yīng)用

于蛋白定量、Western Blot、IP等檢測分析。

  RIPA裂解液(強(qiáng))的主要成分為50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1%Triton

X-100,1%  sodium  deoxycholate,0.1%  SDS以及sodium  orthovanadate,sodium

fluoride,EDTA,leupeptin等多種抑制劑,可有效抑制蛋白降解。

 

注意事項

 

1.為防止蛋白降解,所有的操作盡量在冰上進(jìn)行。

2.使用RIPA裂解液得到的蛋白樣品,可采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,以測定蛋白濃度。

   產(chǎn)品可單獨向本公司訂購,如:K0014  BCA蛋白定量試劑盒。本品含有高濃度的

   去垢劑,不能用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

3.建議在使用RIPA裂解液前,向溶液中加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑,以防止蛋

   白降解,或保持蛋白的磷酸化狀態(tài)。產(chǎn)品可單獨向本公司訂購,如:K2200 蛋白酶抑制劑混合物,K2383 磷酸酶抑制劑混合物。

4.若需獲得更高濃度的蛋白,應(yīng)減少哺乳動物蛋白抽提試劑的使用量。

5.對于培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞,推薦先使用常規(guī)方法消化細(xì)胞,再參考懸浮細(xì)胞蛋白提

   取步驟操作。

6.對于離心獲得的細(xì)胞,若不確定細(xì)胞體積,可根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計算RIPA裂解液的使用

   量。如5×106個Hela細(xì)胞約需加入500 μl RIPA裂解液,以此類推。

 

操作步驟

  I  細(xì)胞樣品

 · 貼壁細(xì)胞蛋白抽提

1.小心傾去貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。

2.可選步驟:若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì),請先使用預(yù)冷的

   PBS漂洗細(xì)胞。

 

3.加入適量RIPA裂解液(使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),試劑使用量請參考

   附表1,在冰上用槍頭吹打貼壁細(xì)胞。

 

表 1   貼壁細(xì)胞RIPA 裂解液使用量推薦表

細(xì)胞培養(yǎng)板類型或培養(yǎng)面積                         RIPA  裂解液使用量

                     100 mm*                         500-1,000 µl

                      60 mm                          250-500 µl

                    6 孔培養(yǎng)板                          200-400 µl /孔

                   24 孔培養(yǎng)板                          100-200 µl /孔

                   96 孔培養(yǎng)板                          50-100 µl /孔

 

 * 對于100 mm培養(yǎng)板培養(yǎng)的107個細(xì)胞 (50 mg)可裂解獲得約3 mg總蛋白(細(xì)胞類型不同略有差異)。

 

4.將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,冰上孵育20分鐘,使細(xì)胞充分裂解。

5.14,000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中,進(jìn)行下一步分析。

 

 · 懸浮細(xì)胞蛋白提取

1.懸浮細(xì)胞2,500×g,離心5分鐘,棄去上清。

2.可選步驟:若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì),請使用PBS漂洗

   細(xì)胞。漂洗后的細(xì)胞懸浮液2,500×g離心5分鐘,棄去上清。

3.加入適量RIPA裂解液(使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),每5×106細(xì)胞加入約

   200-500 µl RIPA裂解液,吹打均勻。

4.冰上放置20分鐘,使細(xì)胞充分裂解。

5.14,000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中,進(jìn)行下一步分析。

  II  組織樣品

1.取適當(dāng)?shù)腞IPA裂解液,在使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑。

2.稱量實驗組織的重量,按照1:10(g/ml)的比例加入RIPA裂解液后將組織剪成細(xì)

   小碎片,用電動勻漿器勻漿處理。若需要濃縮的蛋白提取物,可適當(dāng)減少組織蛋白

   抽提試劑使用量。

3.冰上孵育20分鐘,使細(xì)胞充分裂解。

4.14,000×g 離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中,進(jìn)行下一步分析。

  注:RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中可能會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,屬正?,F(xiàn)象。該透明膠狀物為基因組。

 

 相關(guān)產(chǎn)品信息

 

            目錄號                 產(chǎn)品名稱

            K2333              RIPA裂解液(強(qiáng))

            K2334              RIPA裂解液(中)

            K2335              RIPA裂解液(弱)

            K2336              RIPA裂解液(強(qiáng)中弱套裝)

            K2337              SDS裂解液

            K0002/K0889       哺乳動物蛋白抽提試劑/哺乳動物蛋白抽提試劑盒

            K0004/K0891       組織蛋白抽提試劑/組織蛋白抽提試劑盒

            K0199B             Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒

            K2200              蛋白酶抑制劑混合物

            K2383              蛋白磷酸酶抑制劑混合物

            K0014              BCA蛋白定量試劑盒

            K0022              SDS-PAGE凝膠制備試劑盒

            K0023              ProteinShow-G250蛋白快速染色試劑

 

 

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