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呋喃唑酮代謝物快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
一、原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物呋喃唑酮代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃唑酮代謝物抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含殘留物呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃唑酮代謝物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度: 0.01ppb
u 孵育溫度: 25℃
u 孵育時(shí)間: 30min~15min
u 樣本檢測(cè)下限
肌肉組織 ································· 0.05ppb
雞蛋 ······································· 0.05ppb
蜂蜜 ········································· 0.05ppb
u 交叉反應(yīng)率
呋喃唑酮代謝物 ································· 100%
呋喃它酮代謝物 ······························· <0.1%
呋喃妥因代謝物 ······························· <0.1%
呋喃西林代謝物 ······························· <0.1%
u 樣本回收率
肌肉組織 ································· 95%±25%
雞蛋 ······································ 95%±25%
蜂蜜 ······································· 85%±23%
三、試劑盒組成
1 | 微量測(cè)試孔 | 每條8孔,一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 (1ml/瓶) | 0ppb | 0.01ppb |
0.03ppb | 0.09ppb | ||
0.27ppb | 0.81ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍(lán)色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
10 | 衍生化試劑 | 10ml | 白色帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋
微量移液器:?jiǎn)蔚?/span> 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl
試 劑:氫氧化鈉、K2HPO4·3H2O、正己烷、乙酸乙酯、濃HCl
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
(a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。
(b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
u 樣本前處理需配制
配液1 0.1M K2HPO4溶液:
稱11.4g K2HPO4·3H2O加去離子水溶解定溶至500ml。
配液2 1M HCl 溶液:
取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。
配液3 1M NaOH溶液:
稱4g NaOH加去離子水定容至100ml
配液4 樣本復(fù)溶液:
將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1:1稀釋。
u 樣本處理
(a)肌肉、雞蛋樣本處理方法
稱取1±0.05g的均質(zhì)物,分別加入4ml的蒸餾水,0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,充分振蕩2min;
在37℃過(guò)夜孵育(大約16h)或56℃水浴中孵育(2h);
分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,充分振蕩30s;
在室溫下(20-25℃)4000r/min以上離心10min(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ,在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心;或提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心);
取出3ml的乙酸乙酯到另一個(gè)容器中于50℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。
用2ml正己烷溶解干燥物,再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s;在室溫下4000r/min以上離心10min;去除上層正己烷相(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min,重復(fù)離心);
取50µl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2倍
(b)蜂蜜樣本處理方法
稱取2±0.05g的均質(zhì)物(蜂蜜),分別加入4ml的蒸餾水,0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,充分振蕩2min;
在37℃過(guò)夜孵育(大約16h)或56℃水浴中孵育(2h);
分別加入5ml 0.1M K2HPO4溶液,0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,充分振蕩30s;
在室溫下(20-25℃)4000r/min以上離心10min(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ,在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心;或提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心);
取出3ml的乙酸乙酯到另一個(gè)容器中于50℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;
用2ml正己烷溶解干燥物,再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s;在室溫下4000r/min以上離心10min;去除上層正己烷相(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min,重復(fù)離心);
取50µl下層用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測(cè)定前應(yīng)須知:
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、 所有恒溫孵育過(guò)程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟:
1、 從2~8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。
3、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中,加入酶標(biāo)記物50µl/孔,然后再加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4~5次,每次間隔15~30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
7、 顯色:加入底物A液50µl/孔,再加入底物B液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測(cè)定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),5min內(nèi)讀數(shù)),測(cè)定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.243; 0.01ppb為1.816;0.03ppb為1.415;0.09ppb為0.74;0.27ppb為0.313;0.81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.27ppb~0.81ppb;樣本2的濃度范圍是0.03ppb~0.09ppb,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實(shí)際濃度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索?。?/span>
八、 注意事項(xiàng)
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(20~25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻,否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
1、 儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2~8℃保存,不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請(qǐng)放心使用。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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