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TB基因分型試劑盒HV-3說(shuō)明書
TB Typing Kit HV-3
TB基因分型試劑盒HV-3說(shuō)明書
目錄號(hào):K2571
保存:2-8℃ 1 個(gè)月,-20℃保存一年
組分說(shuō)明
應(yīng)用 Cat. No. YJ2571-20 K2571-50
Kit Size 20 50
VNTR3820 400 μl 1 ml
高分辨3位點(diǎn)VNTR檢測(cè) VNTR4120 400 μl 1 ml
VNTR3232 400 μl 1 ml
DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) I MarkerⅠ 120 μl 300μl
DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) II MarkerⅡ 100 μl 250μl
其它相關(guān)產(chǎn)品K2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒是以分子流行病學(xué)最新研究進(jìn)展1)為基礎(chǔ),經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用結(jié)核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多態(tài)性進(jìn)行基因型分型區(qū)分臨 床菌株,是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)和監(jiān)測(cè)結(jié)核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比,這一分型系統(tǒng)對(duì)中國(guó)流行的菌株具有更強(qiáng)的分辨能力1,2,3),因此特別適合于中國(guó)用戶的需求。
通過(guò)對(duì)各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進(jìn)行精心優(yōu)化,使得本產(chǎn)品具有很強(qiáng)的抗干擾力。與用戶自配試劑相比,本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號(hào)強(qiáng)度,降低了使用粗制模板(煮沸菌液)時(shí)非特異條帶的出現(xiàn)率,使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)便、快捷的同時(shí),提高了檢測(cè)成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學(xué)穩(wěn)定性良好,能有效抵抗反復(fù)凍融(10次)和較長(zhǎng)時(shí)間(一周)的室溫環(huán)境,更好地適應(yīng)了用戶檢測(cè)工作中的靈活性需求。
本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9(貨號(hào) YJ2570)的配套產(chǎn)品。對(duì) VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本,如有必要,可使用本產(chǎn)品做更精細(xì)的進(jìn)一步分型鑒定。本產(chǎn)品中的 3 個(gè)高分辨率檢測(cè)位點(diǎn) VNTR3820,VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)結(jié)合使用可將檢測(cè)的分辨率指數(shù)(Hunter-Gaston index,HGI)提升至 0.993 1)
參考文獻(xiàn)
1) Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium
tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)
2) Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping
Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)
3) Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype
strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9(貨號(hào) YJ2570)的配套產(chǎn)品。待測(cè)菌株應(yīng)先經(jīng)過(guò) VNTR-9 分型檢測(cè),再使用 本產(chǎn)品檢測(cè)。且本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與 VNTR-9 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析。
2. 為避免污染,建議制備生物時(shí)與配制 PCR Mix 在不同的地點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行,并使用不同的移液器。
3. 在樣本 DNA 的收集,抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)注意作好標(biāo)記,同時(shí)防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。
4. 常用試劑和耗材在實(shí)驗(yàn)前需高壓滅菌。
5. 每管 PCR Mix 中均含有不同的引物,不可混用??筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求一次性分裝為不同的量,避免反復(fù)凍融。
6. 為避免打開(kāi)反應(yīng)管時(shí),反應(yīng)液飛濺,開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心,收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。
7. 吸取時(shí)注意不要交叉污染 PCR Mix,建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。
8. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:1×TE 緩沖液(PH=8.0)、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、普通 PCR 儀、DNA 電泳設(shè)備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應(yīng)管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器:0.5-10 μl 和 20-200 μl。
操作步驟
1. DNA 模板制備:
1.1 從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本,重懸于 100 ul TE 中,80°C 滅活 30 分鐘。
1.2 滅活后的菌株拿出 P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下操作:
100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時(shí)注意避免 EP 管蓋子爆開(kāi),避免讓水進(jìn)入管中),立即置于冰上 2 分鐘,12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘,取上清置于另一無(wú)菌 EP 管中,做上標(biāo)記,-20°C 保存。
2 . 檢測(cè)程序:
2.1 取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3,待液體平衡到室溫后,輕微搖晃 3-4 次混勻,然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒,使蓋上的液體回落到管內(nèi)。 2.2 三位點(diǎn) VNTR 分型:對(duì)于 12 位點(diǎn)結(jié)果相同的菌株需進(jìn)一步進(jìn)行 VNTR 分型,即增加以下 4 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行比較。
1)PCR 擴(kuò)增:反應(yīng)體系為 20 μl。
在每個(gè) PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的 PCR Mix,加入 1 μl DNA 模板,混勻。
2)擴(kuò)增條件:
a . VNTR3820:
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 58℃ 30 s 30 個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 90 s
終延伸 72℃ 7 min
b. VNTR3232、VNTR4120:
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 64℃ 30 s 30 個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 90 s
終延伸 72℃ 7 min
3)制膠、電泳:
a:注意事項(xiàng):
重要!每次實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陽(yáng)性(H37Rv 菌株 DNA)和陰性對(duì)照(去離子水)。
關(guān)鍵!本實(shí)驗(yàn)是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎(chǔ)來(lái)判讀 VNTR 位點(diǎn)基因型,因此,為了使結(jié)果準(zhǔn)確,在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作,應(yīng)注意以下幾點(diǎn):
a-1:制膠所用梳子為 18 孔。
a-2:凝膠左右邊上的兩個(gè)孔由于在電泳過(guò)程中容易使條帶變形,影響結(jié)果判讀,舍棄不用,或者在其中一個(gè)孔點(diǎn)上陰性對(duì)照。剩余 16 孔分為 12 個(gè)樣本,3 個(gè) DNA Marker 和 1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。點(diǎn)樣順序分別為“1,2,M,3,4,5,
6, M,7,8,9,10,M,11,12,H37Rv",數(shù)字代表樣本,M 代表 DNA Marker。
a-3:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第—次電泳并使用 Marker I 時(shí),凝膠濃度為 1%,電壓為 150V,時(shí)間為 100-120 分鐘。
a-4:如果擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)大(>1000bp),需要再次電泳并使用 Marker II 時(shí),凝膠濃度為 0.8%,電壓 150V,時(shí)間為150 分鐘。
b:制膠以及電泳過(guò)程:
使用 1%的瓊脂糖凝膠對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×12 cm 膠盤制膠,每塊膠為 80 ml。
b-1:稱取 0.8 g 瓊脂糖,加入 80 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖勻,觀察為均一透明溶液,無(wú)顆粒,再在天平稱量,補(bǔ)入適量的雙蒸水,以保持膠的濃度不受影響。
b-2:待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時(shí)加入 4 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將溫?zé)岬哪z澆灌入 12×12 cm 膠盤。
b-3:待凝膠*凝結(jié)(室溫下放置 40 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,沒(méi)過(guò)膠面 1-2 mm。
b-4:上樣電泳:每塊膠中加入 12 個(gè)樣本(最邊上的孔不加樣),每個(gè)孔中加入 3-5 μl PCR 產(chǎn)物,同時(shí)每塊膠上加三個(gè) 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V,電泳時(shí)間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點(diǎn)最終讀數(shù)是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵,需要統(tǒng)一按照此標(biāo)準(zhǔn)操作。
b-5:部分位點(diǎn)在臨床菌株中存在擴(kuò)增產(chǎn)物大于 1000 bp 的情況,對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,同時(shí)加入 DNA Marker II 作為條帶大小對(duì)照,電壓 150V,電泳時(shí)間 150 分鐘。
4)結(jié)果顯示:
MarkerⅠ
MarkerⅡ
5)結(jié)果分析:
a. 如果不同菌株的 3 個(gè)高變位點(diǎn)基因型也相同,可確定為成簇菌株;
b. 如果高變位點(diǎn)讀數(shù)高度相似,即只有 1-2 個(gè)高變位點(diǎn)有差別,需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)鑒定是否為成簇菌株;
c. 如果 3 個(gè)高變位點(diǎn)基因型都不一致,鑒定為單一菌株。
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