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酶聯(lián)免疫測(cè)定的干擾物質(zhì)
內(nèi)源性物質(zhì)Boscato等指出,大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),影響測(cè)定結(jié)果。主要的內(nèi)源性干擾物質(zhì)有以下幾種。
(1)類(lèi)風(fēng)濕因子 人血清中的IGG型類(lèi)風(fēng)濕因子(RF),可與ELISA系統(tǒng)中捕捉抗體與標(biāo)記二抗的Fc的段直接結(jié)合,從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。制造商采用F(ab)2替代完整的鼠IgG是的辦法。標(biāo)本預(yù)先用熱變性IgG(63℃、10min)的固相吸附劑處理,可以除去RF的干擾。將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效。
(2)補(bǔ)體 補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑從CIq開(kāi)始,在固相一抗和標(biāo)記二抗的過(guò)程中,抗體分子發(fā)生變構(gòu),Fc的CIq分子結(jié)合位點(diǎn)暴露出來(lái),則CIq可將二者連結(jié)起來(lái),造成假陽(yáng)性。用EDTA稀釋標(biāo)本,亦可用56℃下30Min滅活補(bǔ)體的方法。
為避免上述RF及補(bǔ)體的干擾,特別推薦禽類(lèi)如雞、安,鵪鶉等的卵黃抗體,即IgY.它不激活哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體,不結(jié)合抗體分子的Fc,不與RF結(jié)合,從而避免假陽(yáng)性。IgY也不結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Fc受體,為免疫組化提供方便。
(3)嗜異性抗體 人類(lèi)血清中含有可與鼠等嚙類(lèi)動(dòng)物Igs結(jié)合的天然的嗜異性抗體,可將一抗和標(biāo)記二抗連接在一起,造成假陽(yáng)性。在標(biāo)本稀釋中加入過(guò)量動(dòng)物的Igs有效然而亦可因加入的鼠Igs用量不足或者是亞類(lèi)不同而失敗。
(4)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Igs抗體 臨床上逐漸開(kāi)展用鼠源性CD3等單抗治療疾病、用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù),這些患者可能產(chǎn)生抗鼠抗體,而造成假陽(yáng)性。此外,被鼠等嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷后的患者體內(nèi),可有抗鼠Igs的抗體,這要靠了解病史。測(cè)定抗原時(shí),在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Igs,可克服由此而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。
(5)抗靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等的自身抗體,均可干擾抗原或抗體的測(cè)定結(jié)果,需要同時(shí)作抗原與抗體測(cè)定,有時(shí)自身抗體與待測(cè)靶抗原形成復(fù)合物,測(cè)定之前需要用理化方法解離后再測(cè)定。
(6)交叉反應(yīng)物質(zhì) 與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì),如類(lèi)地谷新、類(lèi)aFP樣物質(zhì)等,原來(lái)大都用多抗來(lái)測(cè)定抗原,這少數(shù)交叉抗原決定簇對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不大?,F(xiàn)在普遍用單抗測(cè)定,倘若這個(gè)決定簇正好是所用單抗對(duì)應(yīng)的靶決定簇,結(jié)果是不難相像的,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。
其他物質(zhì):內(nèi)源性酶如堿性磷酸酶,過(guò)氧化物酶對(duì)二步夾心ELISA影響較少,主要干擾免疫組化的結(jié)果。而內(nèi)源性酶和底物,抑制酶活性的藥物等,對(duì)一步法ELISA干擾作用較明顯。此外,血清黏度過(guò)大、血脂過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白等也有干擾作用。應(yīng)該特別指出的是,還有一些體內(nèi)天然存在的物質(zhì),可與靶抗原互相結(jié)合而引起靶抗原變構(gòu),如已證實(shí)膽紅素和2離脂肪酸可結(jié)合aFP分子而導(dǎo)致其分子變構(gòu),與aFP分子結(jié)合的單抗還有Ca依賴性的差別。這些因素都可能會(huì)干擾aFP的測(cè)定結(jié)果。所以,aFP定量、定性測(cè)定不但不同試劑盒之間定量測(cè)定值的可比性很差,而且同一試劑盒的室間、室內(nèi)測(cè)定值的變化也較大。此外還經(jīng)常發(fā)生假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果。
外源性物質(zhì) 采集血清標(biāo)本時(shí),加入的抗凝劑,如肝素、EDTA以及快速分離血清的分離凝膠等,均有干擾作用。標(biāo)本儲(chǔ)存過(guò)程中的變化,如aFP可形成二聚體,影響定量測(cè)定。
測(cè)定試劑中含有酶抑制劑如Na3N,可抑制HRP活性。
除此之外,還有與操作人員的素質(zhì)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)誤差,隨機(jī)誤差等問(wèn)題。