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牛呼吸道疾病綜合癥(BRDC)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光RT-PCR法)
更新時(shí)間:2024-07-18 點(diǎn)擊量:286

牛呼吸道疾病綜合癥(BRDC)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光RT-PCR法)

 

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng):牛呼吸道疾病綜合癥(BRDC)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光RT-PCR法)

 

【包裝規(guī)格】50T/盒

                                                 

【預(yù)期用途】

牛呼吸道綜合癥是由病毒和細(xì)菌等多個(gè)病因相互作用的多重感染引起的。具體因素有天氣和飼料的改變、畜舍過(guò)于擁擠、動(dòng)物缺乏休息、牛棚不舒適、長(zhǎng)途運(yùn)輸后等。在這種情況下,瘦弱而營(yíng)養(yǎng)不良的幼畜十分容易患上牛呼吸道綜合征。本試劑盒適用于檢測(cè)牛呼吸道分泌物,鼻眼分泌物,肺部等樣本中的牛呼吸道疾病綜合癥RNA,適用于牛呼吸道疾病綜合癥感染的輔助診斷。

 

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用1對(duì)牛呼吸道疾病綜合癥特異性引物,結(jié)合1條特異性熒光探針,用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)牛呼吸道疾病綜合癥RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

 

【試劑組成】

     稱(chēng)

  規(guī)      

BRDC酶液

50μL×1管

BRDC反應(yīng)液

950μL×1管

  BRDC陽(yáng)性質(zhì)控品

   50μL×1管

陰性質(zhì)控品

   50μL×1管

說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

 

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過(guò)5次,有效期12個(gè)月。

 

適用儀器

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測(cè)儀。

 

【標(biāo)本采集】

取腸內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié);待檢活,取分泌物和排泄物于離心管中。

 

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò)6個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 

使用方法

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

組織樣品:每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中

分泌物和排泄物樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

 

1.2 RNA提取

為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取,嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

 

2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照;樣品每滿(mǎn)7份,多配制1份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

BRDC反應(yīng)液

酶液

用量

19μL

1μL

 

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;

熒光通道選擇:檢測(cè)通道(Reporter Dye)HEX檢測(cè)牛呼吸道疾病綜合癥,淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間

收集熒光信號(hào)

1

1 cycle

50

15min

2

1 cycle

95℃

3min

3

45 cycles

95

15sec

55℃

30sec

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

 

5.2 結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道Ct值≤38.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線。

可疑檢測(cè)通道38.0<Ct值<40.0,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<40.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú)Ct值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。

 

6. 檢測(cè)方法的局限性

樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

 

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無(wú)明顯擴(kuò)增曲線且無(wú)Ct值顯示;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且Ct值≤30;

以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

 

8. 性能指標(biāo)

1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評(píng)價(jià)敏感性98%以上。最DI檢測(cè)限不低于1000copies/ml。

2)特異性:100%。

3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。

 

注意事項(xiàng)

所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完全混勻并短暫離心;

反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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