一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測定試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內神經、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中， 特別是神經組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質，發(fā)揮信號傳遞的作用，是一
種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理：
NO 在體內或水溶液中極易氧化生成 NO2— ，在酸性條件下，NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在 550nm 處有特征吸收峰，測定其吸光值， 可以計算 NO 含量。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL× 1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。（用之前震蕩溶解后使用）
試劑二：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)
樣品處理：
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，
加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g ，4℃ , 離心 15min ，取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定。
測定步驟和操作表：
1 、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 550nm。
2 、操作表
空白管 | 測定管 | |
樣品(μL） | 100 | |
提取液(μL） | 100 | |
試劑一 (μL） | 50 | 50 |
試劑二(μL） | 50 | 50 |
混勻，室溫靜置 15min ，于微量石英比色皿/96 孔板，測定 A550 ， ΔA=A 測定-A 空白 | ||
NO 含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103 ，R2= 0. 9986
1 、組織樣品：
（1）按樣本質量計算
NO 含量(μmoL/g 鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷Cpr
2 、細胞：
NO 含量( μmol/104 cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數量）× 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷細胞數量（萬個）
3 、其他樣品：
NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125× ( ΔA +0.0103）
V 反總：反應總體積，0.2mL；V 樣：反應中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103 ，R2= 0. 9986
1 、組織樣品：
（1）按樣本重量計算
NO 含量(μmoL/g 鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷ Cpr
2 、細胞：
NO 含量( μmol/104 cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數量）× 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷細胞數量（萬個）
3 、 其他樣品：
NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣=250× ( ΔA +0.0103）
V 反總：反應總體積，0.2mL；V 樣：反應中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
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