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021-65232515
人外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【貨號(hào)】
LTS1077
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A. 適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B.耗材
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)地 |
15ml離心管散裝 | 339650 | 美國 NUNC |
15ml離心管架裝 | 339651 | 美國 NUNC |
50ml離心管散裝 | 339652 | 美國 NUNC |
50ml離心管架裝 | 339653 | 美國 NUNC |
無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先根據(jù)樣本量大小,分以下幾種情況:
一、 使用 15ml 離心管時(shí):
情況 A:血液樣本量小于 3ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
1. 取一支 15ml 離心管,加入 3ml 分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上,400-650g,離心 20-30min(注:根據(jù)血 液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長,具體離心條件 需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。
3. 離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向所得離心管中 加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。
5. 250g,離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
8. 250g,離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B:血液樣本量為 3-6ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
1. 取一支 15ml 離心管,先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上,450-650g,離心 20-30min(注:根據(jù)血 液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長,具體離心條件 需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果,但zui大離心力不超過 1200g)。
3. 離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向所得離心管中 加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。
5. 250g,離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
8. 250g,離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、 使用 50ml 離心管時(shí):
情況 A:血液樣本量為 6-10ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
1. 取一支 50ml 離心管,先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上,500-950g,離心 20-30min(注:根據(jù)血 液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長,具體離心條件 需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果,但zui大離心力不超過 1200g)。
3. 離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向所得離心管中 加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。
5. 250g,離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
8. 250g,離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B:血液樣本量為 10-20ml 時(shí),實(shí)驗(yàn)方法如下:
1. 取一支 50ml 離心管,先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上,500-1100g,離心 20-30min(注:根據(jù) 血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長,具體離心條 件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果,但zui大離心力不超過 1200g)。
3. 離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向所得離心管中 加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118),混勻細(xì)胞。
5. 250g,離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號(hào):2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
8. 250g,離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),血液存放時(shí)間越長,細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。
3. 吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒
細(xì)胞數(shù)量增加。
4. 吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5. 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,請(qǐng)以尋求幫助,具體
詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6. 當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時(shí),*稀釋方法:將血液與樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào): 2010C1119)1:1 稀釋混勻備用。注:不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣
本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟 封后置常溫保存。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。 【參考值(參考范圍)】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
1. 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù) 注:上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞
分離、純化、擴(kuò)增及鑒定指導(dǎo)手冊(cè)",并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不 | 細(xì)胞密度過小 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離 心時(shí)間,對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級(jí)原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注:在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。