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LGS1072Z狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液說明書
狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液說明書
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:
| 名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 編號 |
A | 狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液 |
| 200ml |
B | 樣本稀釋液(贈(zèng)品) | 2010C1119 | 200ml |
C | 清洗液(贈(zèng)品) | 2010X1118 | 200ml |
D | F液(贈(zèng)品) | F2013TBD | 200ml |
E | 說明書 |
| 1份 |
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A.適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B.耗材
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)地 |
15ml離心管散裝 | 339650 | 美國 NUNC |
15ml離心管架裝 | 339651 | 美國 NUNC |
50ml離心管散裝 | 339652 | 美國 NUNC |
50ml離心管架裝 | 339653 | 美國 NUNC |
無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
|
|
【檢驗(yàn)方法】
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
1.首先制備骨髓單細(xì)胞懸液,制備方法詳見“骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。
2.取一支 15ml離心管,加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的分離液(注:分離液zui少不得少于
3ml)。
3.用吸管小心吸取骨髓單細(xì)胞懸液加于分離液液面上,400-550g,離心20-30min。(注:
根據(jù)骨髓單細(xì)胞懸液量確定離心條件,骨髓單細(xì)胞懸液量越大,離心力越大,離心時(shí)間
越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。
4.離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色目
的細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
5.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一15ml離心管中,向離心管中加入
10ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細(xì)胞。
6.250g,離心 10min。
7.棄上清。
8.用吸管以5ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
9.250g,離心 10min。
10.重復(fù) 7、8、9,棄上清后以 0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
11.差異貼壁法純化細(xì)胞
(1)用干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號: CSC2015TBD)或干細(xì)胞*培養(yǎng)基(產(chǎn)品
編號:HCSC2015TBD)以 1.5-3×106個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板
或細(xì)胞瓶中,放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
(2)2-4小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。
(3)10-24小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注:
a)
無血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。
由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
【注意事項(xiàng)】
1.全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,zui
好在取樣2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),樣品存放時(shí)間越長,細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過6h后
分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會(huì)變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。
3.吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒
細(xì)胞數(shù)量增加。
4.分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本量時(shí),分離效果更佳。
5.如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,請技術(shù)以尋求支持幫助。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存,有效期 2年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟
封后置常溫保存。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
【參考值(參考范圍)】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2.所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3.所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4.所獲得干細(xì)胞的鑒定方法。
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注:上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”,并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離
心時(shí)間,對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注:在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,
離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準(zhǔn)。